串聯親和純化質譜TAP-MS * 實驗介紹
串聯親和純化質譜(TAP MS)技術采用兩輪純化的方法調取誘餌蛋白及其互作蛋白復合體。首先,在目的細胞中過表達帶有TST-Flag雙標簽的誘餌蛋白;樣本經裂解后,先與Streptactin樹脂孵育、初次洗滌及洗脫,得到首次純化的蛋白復合物;再將此蛋白復合物與anti-Flag樹脂結合、再次洗滌及洗脫,得到第二輪純化的蛋白復合物;最后,質譜鑒定復合物中的誘餌蛋白互作蛋白。
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串聯親和純化質譜TAP-MS * 實驗流程

串聯親和純化質譜TAP MS * 應用背景
隨著確定細胞內蛋白質的相互作用成為當今生命科學的研究熱點,雙雜交技術已經廣泛應用于研究蛋白—蛋白間的相互作用,但由于其篩選步驟復雜,假陽性結果較多,難于量化,故不能滿足大規(guī)模蛋白質研究的需要,因此串聯親和純化(TAP)技術以其高效、高純度、以及能夠高度模擬真實生理條件等優(yōu)勢,迅速成為篩選、發(fā)現和鑒別新的相互作用蛋白質的主流技術之一。
目前,TAP技術與質譜技術的聯用,以及質譜技術的自動化,使得大規(guī)模地分析相互作用的蛋白質在技術上成為可能。
TAP技術采用兩步親和純化,提高了純化產物的特異性,具有周期短、假陽性結果少等優(yōu)點。通過這種方法鑒定到的蛋白質相互作用能真實地反映出細胞中蛋白質分子之間的聯系,實驗結果更加接近真實情況,而且TAP技術還特別適用于蛋白質組水平上的大規(guī)模研究。
TAP(串聯親和純化)檢測服務 |
服務項目 | 服務內容 | 結果交付 | 實驗周期 | 客戶提供 | 價格
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TAP MS | 構建誘餌蛋白的TAP雙標簽表達載體
| 載體質粒、甘油菌、測序結果和實驗報告 | 約2周 | 含有誘餌基因序列的質粒模板及測序文件 待測細胞及其培養(yǎng)方法 實驗信息表(樣本信息、誘餌蛋白序列) |
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包裝慢病毒并進行誘餌蛋白的穩(wěn)定表達細胞株篩選 | 慢病毒包裝和穩(wěn)轉株實驗報告 | 5-6周 |
Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白 | Western blot檢測圖 | 7-8周 |
TAP調取誘餌蛋白及其互作蛋白 (2組:實驗組、空載對照組) | TAP實驗報告 |
Western blot檢測TAP產物中的誘餌蛋白 | Western blot檢測圖 |
LC-MS/MS定性檢測TAP產物的蛋白、篩選實驗組獨有蛋白(潛在互作蛋白) | 質譜檢索表格、互作蛋白篩選表格、檢測報告
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針對互作蛋白做生物信息學分析(GO、KEGG pathway、String) | 生物信息學分析結果和報告 | 1周 |
串聯親和純化TAP MS * 結果示例

TAP MS:Western blot檢測圖

TAP MS:質譜檢索表格(部分展示)
TAP-MS實驗研究案例—客戶文章解析
Hadir Marei. et al: Differential Rac1 signalling by guanine nucleotideexchange factors implicates FLII in regulating Rac1-driven cell migration.
Nat Communications. 2016,IF=14.919.
鳥嘌呤核苷酸交換因子的差異rac1信號涉及FLII在調節(jié)rac1驅動的細胞遷移中的作用
研究概述
小的GTP酶 rac1與腫瘤的形成和擴散有關。當被鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)激活時,rac1與細胞中的各種蛋白質結合,從而調節(jié)各種功能,包括細胞遷移。然而,當在臨床環(huán)境中以rac1為靶點時,rac1的激活可以導致相反的遷移表型,增加了加劇腫瘤進展的可能性。這就需要確定影響rac1驅動的細胞運動的因素。本研究證實P-Rex1不僅能激活rac1,而且還能將蛋白質(如FLII)定向到rac1的活性形式,以介導特定的細胞功能,包括細胞收縮,從而使P-Rex1能夠促進細胞遷移。因此,這項研究提供了對以前未報道的P-REx1-rac1介導細胞遷移的細胞功能的洞察力,并強調了P-Rex1和rac1可能驅動癌癥擴散其他模式。
研究路線
過表達與 pull down實驗證實Tiam1和P-Rex1誘導不同的rac1下游效應
通過TAP/ SILAC結合的方法檢測 Tiam1或 P-Rex1誘導后的rac1相互作用體,證實Tiam1和P-Rex1對racl互動體有不同的調控作用
免疫共沉淀、 GST pull down和PLA實驗結果證實FLII優(yōu)先與活性racl結合FLII是一種新的富含P-RExl的rac1結合伙伴
結構域分析證實FLII通過不同的結構域與rac1和P-Rex1結合
Pull down實驗和細胞遷移實驗證實FLII是P-REx1-rac1驅動的細胞遷移所必需的
基因敲除實驗表明P-Rex1可以通過FLII介導特定的細胞功能,包括細胞收縮,從而促進細胞遷移
TAP MS * 客戶文章
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