SILAC-IP * 實(shí)驗(yàn)原理
用SILAC結(jié)合免疫共沉淀(CoIP)尋找相互作用蛋白是SILAC在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究基礎(chǔ)上的進(jìn)一步應(yīng)用,稱(chēng)之為SILAC-IP技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)質(zhì)譜鑒定和分析蛋白質(zhì)相對(duì)量來(lái)判斷是否是特異性結(jié)合誘餌蛋白,當(dāng)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中某個(gè)蛋白質(zhì)量含量達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異時(shí),就判定這個(gè)蛋白質(zhì)與誘餌蛋白質(zhì)具有相互作用。SILAC技術(shù)是先將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白帶上不同的同位素,即重鏈、輕鏈氨基酸蛋白。復(fù)合物分離后,混在同一管中做酶切質(zhì)譜等。這樣既能鑒定到復(fù)合物蛋白,又能根據(jù)同位素峰強(qiáng)度判斷誘餌蛋白組和對(duì)照組中蛋白的相對(duì)含量,從而更準(zhǔn)確地判斷出互作蛋白。
SILAC-IP * 實(shí)驗(yàn)方案
不同的實(shí)驗(yàn)背景和目的需對(duì)應(yīng)用不同方案,輝駿生物提供以下三種SILAC-IP實(shí)驗(yàn)方案:
方案一:以野生型細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料
1.分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)細(xì)胞,取等量標(biāo)記好的細(xì)胞提取蛋白質(zhì);
2.提取的輕鏈、重鏈細(xì)胞總蛋白分別用Normal IgG和抗bait蛋白的特異抗體做Co-IP;
3.混合輕、重鏈Co-IP產(chǎn)物;
4.胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

方案二:以過(guò)表達(dá)誘餌蛋白的細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料
1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)正常對(duì)照細(xì)胞和過(guò)表達(dá)誘餌蛋白的細(xì)胞株(帶標(biāo)簽),取等量標(biāo)記好的細(xì)胞分別提取蛋白質(zhì),并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用誘餌蛋白抗體做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

方案三:以干擾誘餌蛋白的細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料
1. 分別用輕鏈、重鏈氨基酸培養(yǎng)RNAi 誘餌蛋白的細(xì)胞株和正常對(duì)照細(xì)胞株,取等量標(biāo)記好的細(xì)胞分別提取蛋白質(zhì),并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用誘餌蛋白抗體做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

SILAC-IP * 應(yīng)用背景
免疫共沉淀(Co-IP)在分離純化蛋白復(fù)合物過(guò)程中,不可避免地會(huì)出現(xiàn)非特異結(jié)合蛋白,這些蛋白會(huì)一并被質(zhì)譜鑒定出來(lái),成為假陽(yáng)性的互作蛋白,影響后續(xù)挑選驗(yàn)證。 傳統(tǒng)的判斷假陽(yáng)性互作蛋白方法是:用誘餌蛋白組鑒定到的蛋白列表,扣除掉對(duì)照組鑒定到的蛋白列表,作為“互作蛋白”。但很多真實(shí)的互作蛋白,比如豐度比較高的蛋白,在對(duì)照組中也會(huì)出現(xiàn),而傳統(tǒng)的方法就會(huì)被排除掉。SILAC-IP技術(shù)將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白帶上不同的同位素,結(jié)合質(zhì)譜分析,既能鑒定到復(fù)合物蛋白,又能根據(jù)同位素峰強(qiáng)度判斷誘餌蛋白組和對(duì)照組中蛋白的相對(duì)含量,從而更準(zhǔn)確地判斷出互作蛋白。
相較于傳統(tǒng)的免疫共沉淀和pull down技術(shù),SILAC-IP技術(shù)特異性強(qiáng),假陽(yáng)性極低,通量高,靈敏度高,能直接檢測(cè)出與bait蛋白互作的其他蛋白的相對(duì)含量;適合于可傳代細(xì)胞,尤其是易轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
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SILAC-IP * 輝駿服務(wù)內(nèi)容
SILAC-IP(SILAC標(biāo)記的免疫共沉淀)檢測(cè)服務(wù) |
服務(wù)項(xiàng)目 | 服務(wù)內(nèi)容 | 結(jié)果交付 | 實(shí)驗(yàn)周期 | 客戶(hù)提供 | 價(jià)格
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SILAC-IP | Co-IP預(yù)實(shí)驗(yàn) | input和CoIP產(chǎn)物的Western blot檢測(cè)圖
| 2-3周 | 未標(biāo)記的待測(cè)細(xì)胞 SILAC標(biāo)記完全的待測(cè)細(xì)胞 誘餌蛋白的IP級(jí)抗體 實(shí)驗(yàn)信息表(樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白序列) |
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SILAC標(biāo)記效率檢測(cè) | 標(biāo)記效率檢測(cè)表 標(biāo)記效率檢測(cè)報(bào)告 | 2-3周 |
Western blot檢測(cè)SILAC標(biāo)記細(xì)胞(input)中的誘餌蛋白 | Western blot檢測(cè)圖 | 7-8周 |
CoIP實(shí)驗(yàn)調(diào)取誘餌蛋白及其互作蛋白 | Western blot檢測(cè)圖 CoIP實(shí)驗(yàn)報(bào)告 |
IP產(chǎn)物的SILAC蛋白定量檢測(cè)和分析 | 質(zhì)譜檢索表 互作蛋白篩選表 互作蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果 SILAC檢測(cè)和分析報(bào)告 |
SILAC-IP * 結(jié)果示例

silac ip:質(zhì)譜檢索表格(部分展示)
SILAC-IP * 客戶(hù)文獻(xiàn)
分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
輝駿實(shí)力


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